辅助生殖技术--卵母细胞冷冻的现状
卵母细胞冷冻的成功依赖于影响卵母细胞冷冻后复苏的形态学和生理上的因素。人类卵母细胞，对低温非常敏感，因为其体积及生理方面的因素,在细胞内冰晶形成过程中，很容易遭受死亡或亚死亡性损伤。重要的生理因素是细胞在冷冻过程中冰晶形成导致的细胞膜或细胞器破裂,但适当的细胞脱水可阻止这种情况，因此减少细胞内的水分可减轻冷冻过程对细胞的损伤。脱水的过程受平衡液及冷冻液的浓度影响，在细胞脱水时两者比例合适,可减少冰晶造成的损伤、渗透压改变造成的损伤、细胞骨架和染色体的改变等，zui后细胞在经历冷冻过程后存活[1]。
对冷冻保护剂的研究一直未间断过。冷冻保护剂是一种合理的盐类缓冲液,似乎可减少高盐对细胞的损害。冷冻保护剂包括:渗透性保护剂,如丙二醇(propanediol ,PROH)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、二甲亚砜( dimethyl sulfoxide , DMSO)等;非渗透性保护剂,如蔗糖、海藻糖、聚乙二醇等。联合使用玻璃化冷冻保护剂可降低毒性，提高保护作用。如Gautam等[2]采用玻璃化冷冻及慢速冷冻牛卵细胞时发现,EG和DMSO混合物是一种有效冷冻保护剂，使用这种冷冻保护剂可提高卵细胞存活率、卵裂率及囊胚形成率,玻璃化冷冻程序配合合理冷冻保护剂更适宜卵母细胞冷冻。玻璃化冷冻的基本原理是高浓度冷冻保护剂经急速降温后,由液态转化为外形类似玻璃化的非晶体化固体状态。由于冷却谏度很快，以至干在低温形成透明的玻璃状周体时没有冰晶形成,保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。适宜的冷冻保护液是目前玻璃化冷冻卵母细胞的焦点，而海藻糖在此方面表现出明显优势并逐渐得到重视。
海藻糖在冷冻卵母细胞中的应用
Eroglu等研究发现,使用0.5mmol/L的海藻糖联合0.5mmol/L的DMSO对人类卵子进行玻璃化冷冻，结果冷冻后卵母细胞获得较高的成活率,而与新鲜卵母细胞比在受精率和胚胎发育率上无统计学差异。
Eroglu等研究小鼠卵母细胞内注射0.1mol/L的海藻糖,利用高xiao液相色谱和脉冲电流检测仪对卵母细胞内的海藻糖行追踪研究。研究发现,在卵母细胞第1次卵裂时卵母细胞内的葡萄糖浓度明显高于对照组,且胞内海藻糖浓度减少40%;而在注射早期以及囊胚形成期两者胞内的葡萄糖浓度的差异不大，海藻糖的浓度在囊胚阶段减少5倍。这种不同可以解释为海藻糖转化为葡萄糖的代谢和葡萄糖转运体的表达增加,使胞内海藻糖浓度减少。卵裂时海藻糖由二糖转变为单糖供卵母细胞利用,而对卵母细胞本身无任何du害作用。
Berlinguer等对未成熟的羊卵进行研究,发现用海藻糖添加的体外成熟培养基中成熟的羊卵与未使用海藻糖对照组比，受精率(92.5%比91.1%)
卵裂率(95.4%比96. 1% )囊胚形成率(13%比14.3%)无明显差异,但利用碘化丙啶(propidium iodide ,PI)对细胞染色发现,海藻糖组细胞完整性明显高于对照组,说明在稳定细胞膜的结构、冷冻和复苏过程中的发育潜能方面,海藻糖组羊卵未受到影响。
Hamaratoglu等[7]认为,海星卵母细胞在慢速冷冻过程中很容易死亡,原因是这种卵母细胞对渗透压高度敏感和在零下温度极易形成胞内的冰晶,所以普通冷冻方法无作用。研究发现,将卵母细胞短暂放置于1.5mol/LDMSO和1mol/L的海藻糖中快速冷冻,结果34%卵母细胞成活。说明新的用于海星卵母细胞冷冻的方法是可行的。
海藻糖是生物大分子非特异性的天然保护剂，其在生物领域特别是卵母细胞的玻璃化冷冻方面有更加广fan的应用前景。进-步寻找有效且安全的海藻糖载入卵母细胞内的方法,在联合其他渗透性保护剂的基础上利用海藻糖特殊的功能对卵母细胞冷冻保存,探索到一种更适合于冷冻卵母细胞的方法,为人类辅助生殖技术的发展提供动力。
为什么海藻糖可以被应用到冷冻卵母细胞中？这就得从海藻糖的应用原理说起。
在高温、高寒、高渗透压及干燥、脱水、冷冻时等恶劣环境条件下，海藻糖在细胞表面能形成*的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。目前海藻糖已用于多种生物细胞研究，如：红细胞、血小板及生殖细胞等的离体长期保存，且均表现出*的功能。海藻糖的发现为低温保存卵母细胞提供可利用的价值，其作为冷冻保护剂对卵母细胞进行玻璃化冷冻成为新的冷冻技术方法。海藻糖的作用原理包括：“水替代”假说、“玻璃态”假说、“优先排阻”假说。
“水替代”假说。认为,海藻糖能与生物分子形成氢键,代替空间结构必需的水分子。即生物体内的蛋白质核酸、糖类、脂质类及其他生物大分子周围均包着一层水膜,这层水膜是维持生物大分子结构、功能的物质基础,当干燥、冷冻等条件下失去水膜时,海藻糖分子能在失水部位与生物大分子以氢键连接,形成一层保护膜代替失去的结构水膜,而不至于使生物分子丧失活性[1]。
“玻璃态”假说。海藻糖的高xiao生物保护作用与其玻璃态形成有关。海藻糖水溶液干燥时黏度随浓度的增加而增大，当达到一定浓度且糖未结晶时，其水溶液就会玻璃化,这种状态称为玻璃态。“玻璃态”假说认为,当生物成分干燥时,海藻糖紧密地包住相邻的分子,形成一种在结构上与玻璃状的冰类似的碳水化合物玻璃体,其扩散系数很低,分子运动和分子变性非常微弱,能够使生物分子维持-定的空间结构[2]。
“优先排阻”假说。海藻糖等小分子糖类不直接与蛋白质空间结构相互作用,而是优先与蛋白质表面的水分子结合，结果蛋白质的溶剂化层半径减小，分子结构更紧密,构象更稳定,有利于抵御外界环境的影响。该假说可解释溶液中海藻糖对生物分子的稳定作用。海藻糖水合体积为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖的2.5倍,在溶液中可结合更多的水分子。这-结果可很好地解释海藻糖保护生物分子的效果优于其他低聚糖的原因[3]。
